L’invenzione ha per oggetto un metodo diagnostico molecolare per rilevare la presenza del fungo fitopatogeno Macrophomina phaseolina in campioni di terreno, semi e pianta infetti. I sintomi causati da M. phaseolina spesso sono simili a quelli di altri patogeni e per confermarne la presenza, i campioni devono essere sottoposti a diagnosi di laboratorio lunghe e laboriose. La diagnosi precoce e lo screening di M. phaseolina richiedono un test semplice, rapido ed economico, senza l’uso di apparecchiature e reagenti sofisticati e costosi non sempre presenti nei normali laboratori.
Stato del brevetto
CONCESSO
Numero di priorità
IT20170057466
Data di priorità
26/05/2017
Licenza
EUROPA
Mercato
L’impatto negativo che le malattie hanno sulle produzioni agrarie è legato a fattori di ordine economico-produttivo e ambientale. La gestione fitosanitaria con prodotti chimici consente di ottenere produzioni qualitativamente valide ma incide sensibilmente sul prezzo finale del prodotto. In questo contesto, una corretta e rapida diagnosi degli agenti patogeni che inficiano la qualità del prodotto finale assume un ruolo di primaria importanza. La necessità di metodi diagnostici rapidi ed affidabili costituisce un requisito importante per lo sviluppo di strategie di controllo ecosostenibili.
Problema
Il patogeno fungino Macrophomina phaseolina, diffuso in tutto il mondo, ha come gamma di ospiti oltre 500 specie vegetali. Il fungo attacca colture che sono la fonte di alimenti di base, quali mais, sorgo, girasole e soia. Altre colture interessate includono fagiolo, colza, cotone, tabacco, fragola e diverse piante orticole. La malattia può causare perdite di produzione fino al 90% nel girasole, 30-60% nella fragola, 50% nella soia e 70% nel mais. Quando le condizioni sono favorevoli per lo sviluppo di M. phaseolina, le infezioni possono anche causare il fallimento dell’intera coltura. I sintomi causati dal patogeno spesso sono simili a quelli di altri agenti patogeni e per confermarne la presenza, i campioni devono essere sottoposti a una diagnosi di laboratorio durante la quale l’agente patogeno deve essere isolato dai tessuti malati e identificato.
Uno strumento diagnostico “ideale” dovrebbe garantire elevata specificità, sensibilità, rapidità, riproducibilità, semplicità di esecuzione, economicità, minimo rischio per l’operatore, la possibilità di effettuare diagnosi anche direttamente da matrice infetta (tessuto vegetale e terreno) o addirittura “in situ”. La popolarità e l’ampio utilizzo di uno strumento diagnostico è sicuramente legato alla capacità che tale strumento ha di rispondere a tutti questi requisiti.
Limiti attuali tecnologie / Soluzioni
Accanto alle metodologie di diagnosi più tradizionali (tecniche dirette), che necessitano di lunghi tempi di esecuzione e di personale altamente qualificato, da qualche decennio si è assistito allo sviluppo di tecniche diagnostiche indirette, che mirano all’identificazione dei patogeni mediante l’analisi dei loro acidi nucleici. La sempre maggiore richiesta di strumenti diagnostici “pronti all’uso” e la grande importanza che riveste il fungo M. phaseolina a livello globale sono due fattori chiave che aprono ampie opportunità di sviluppo e di mercato di kit diagnostici innovativi per l’identificazione di tale patogeno.
La diagnosi precoce e lo screening di M. phaseolina richiedono infatti un test semplice, rapido ed economico, che possa effettuarsi senza l’uso di apparecchiature e reagenti sofisticati e costosi non sempre presenti nei normali laboratori.
Una rapida diagnosi delle malattie delle produzioni agrarie permette di agire tempestivamente in campo offrendo maggiore competitività alle imprese agricole. L’obiettivo di sostenibilità del reddito delle imprese agricole nel futuro potrà essere raggiunto anche con l’ausilio di kit diagnostici rapidi e specifici.
Killer Application
L’invenzione brevettata potrebbe trovare impiego nei laboratori di diagnostica sia pubblici che privati e nei laboratori dei Servizi di Ispezione Fitosanitaria che processano un numero molto elevato di campioni. Le aziende produttrici di kit diagnostici potrebbero avere interesse per un kit come quello proposto che per l’impiego non necessita di operatori specializzati. Infine, potrebbe essere impiegato nei test in laboratori di patologia clinica umana, in quanto il fungo è anche un patogeno umano opportunistico.
Un primo prototipo del kit diagnostico è già stato sviluppato e validato in laboratorio e in campo, è stato allestito un mini-laboratorio portatile di diagnosi fitopatologica capace di realizzare analisi del DNA direttamente “sul campo” (LABINABAG).
Tecnologia e nostra soluzione
L’idea dello sviluppo di un kit diagnostico molecolare per l’identificazione di M. phaseolina nasce dalla messa a punto di una tecnica PCR-NALFIA con primer specie specifici, MP102F e MP102R, poi brevettati. I primer specie specifici sono marcati rispettivamente in 5’ con biotina e FITC, in esperimenti di PCR. Gli ampliconi sono rilevati con uno stick a flusso laterale che funge da biosensore e contiene nanoparticelle d’oro funzionalizzate. Il test NALFIA è condotto in 10 minuti: vengono mescolati in una provetta 10 µl del prodotto di PCR con 80-100 µl di buffer, viene immerso lo stick nella soluzione e attendere 2-3 minuti affinché la soluzione salga per capillarità. Le bande del controllo e del campione positivo sono nettamente visibili ad occhio nudo dopo pochi minuti. Il saggio, oltre ad essere molto sensibile, è anche molto rapido ed elimina la visualizzazione degli ampliconi mediante gel elettroforesi.
La diagnosi viene realizzata in circa 2 ore e prevede in sintesi: la preparazione del campione, l’estrazione degli acidi nucleici, la reazione PCR-NALFIA.
Nell’attuale kit diagnostico tutti i componenti della PCR, compresi i primer specie specifici brevettati sono liofilizzati. Questo consente di avere uno strumento diagnostico pronto per l’uso a temperatura ambiente e di poter eseguire le analisi non solo in laboratorio ma anche direttamente in campo. Il formato liofilizzato viene semplicemente ricostituito aggiungendo acqua nuclease-free insieme al DNA target risparmiando tempo e riducendo il rischio di contaminazioni.
Vantaggi
Il prototipo risponde alla necessità sia di rilevare il patogeno in tempo reale sia di semplificare la tecnica di diagnosi al fine di esportare le tecnologie messe a punto nei laboratori di ricerca a quelli di analisi dove i campioni da processare sono molti e i tempi della diagnosi devono essere compressi per rispondere alle esigenze degli agricoltori. Le uniche soluzioni generiche in commercio prevedono di inserire all’interno della provetta anche i primer. Da un lato queste soluzioni sono più versatili ma, la necessità di avere familiarità con una moltitudine di saggi e di disporre di set di primer e sonde per il rilevamento di ciascun patogeno, non consente al diagnostico la possibilità di avere tutti i saggi a portata di mano e pronti per l’uso.
Roadmap
Lo sviluppo industriale del prototipo di kit commerciale sarà effettuato attraverso il perfezionamento del prototipo già esistente (TRL 4/5) approfondendo i seguenti aspetti:
Sarà intrapresa una collaborazione con un’azienda specializzata nel settore della liofilizzazione con comprovata esperienza nello sviluppo di prodotti per la diagnostica molecolare.
TRL
Il team
