L’invenzione propone un metodo per rilevare i cambiamenti della cromatina, in particolare dell’eterocromatina il cui stato e accessibilità è indicatore dello stato di salute della cellule o della presenza di specifiche malattie e tumori. Pertanto, metodi affidabili per caratterizzare l’eterocromatina e le sue alterazioni sono essenziali per la comunità scientifica biomedica.
Stato del brevetto
DEPOSITATO
Numero di priorità
EP3640330
Data di priorità
15/10/2018
Licenza
EUROPA
Mercato
La nostra tecnologia può essere utilizzata nella ricerca scientifica (SOM - serviceable getable market) perché è un protocollo rapido ed economicamente competitivo per analizzare l'accessibilità della cromatina. I nostri studi preliminari suggeriscono anche un mercato potenziale nel campo diagnostico (SAM - serviceable addressable market). Infatti i nostri dati supportano la possibilità di utilizzare la nostra tecnologia per stratificare i pazienti oncologici e stiamo lavorando per trovare nuovi marker di struttura del DNA che possano predire la progressione tumorale.
Problema
La cromatina all'interno del nucleo ha una struttura complessa fondamentale per la funzione genomica (figura a seguire). Le caratteristiche fenotipiche e funzionali di ogni cellula, la loro plasticità e la loro capacità di rispondere agli stimoli esterni dipendono dal rimodellamento della cromatina. Immagini di microscopia elettronica dei nuclei eucariotici mostra i compartimenti della cromatina, noti come eucromatina ed eterocromatina. L'eucromatina più accessibile e meno condensata è generalmente arricchita in geni espressi. Invece, l'eterocromatina contiene DNA altamente condensato ed è trascrizionalmente inattiva. Alterazioni nella conformazione o localizzazione dell’eterocromatina sono caratteristici di difetti di sviluppo, di malattie genetiche e del cancro. Invece, la sua corretta conformazione è un segno distintivo delle cellule sane. Pertanto, metodi affidabili per caratterizzare l'eterocromatina e le sue alterazioni sono essenziali per la comunità scientifica e biomedica.
Limiti attuali tecnologie / Soluzioni
Negli ultimi anni, lo sviluppo di tecniche sperimentali basate sul sequenziamento (NGS) è stata determinante per lo studio della struttura e funzione della cromatina. Molte di queste tecniche in origine sono state progettate per mappare le regioni della cromatina attiva. Per l’eterocromatina esistono poche opzioni. I metodi più comunemente usati includono ChIP-seq o DamID-seq che mirano a componenti di lamine nucleari o ChIP-seq per i marker istonici associati all'eterocromatina (metilazione H3K9). Tali tecniche soffrono di alcune limitazioni sperimentali come l'espressione esogena di un transgene (DamID-seq) o il crosslink e l’utilizzo degli anticorpi (ChIP-seq). Di recente sono stati proposti altri metodi di sequenziamento per la mappatura di LAD ed eterocromatina, come il gradient-seq e il protect-seq, ma entrambi richiedono il crosslinking.
Killer Application
Stiamo lavorando su alcuni nuovi protocolli derivati da SAMMY-seq:
- L’entrapped RNA SAMMY-seq (eR-SAMMY-seq)
Questo protocollo, già messo a punto, consente l'estrazione dell'RNA associato alla cromatina, con il vantaggio rispetto ai metodi precedenti di frazionare ulteriormente la cromatina (Figura a seguire). Quindi con questa tecnologia possiamo isolare l'RNA associato all'eucromatina ed all'eterocromatina. E’ possibile produrre un kit per l'analisi dell'RNA associato alla cromatina, utilizzabile nel campo della ricerca scientifica. In alternativa, un kit combinato potrebbe consentire l'isolamento contemporaneo del DNA specifico della frazione e dell'RNA associato.
- La SAMMY-seq su singola cellula (sc-SAMMY-seq)
Il protocollo è stato solo progettato. Tra i metodi esistenti, solo la tecnologia DamID-seq, consente l'identificazione dei domini associati alla lamina nucleare nelle singole cellule, ma non può essere utilizzato su cellule o tessuti primari. Quindi lo sviluppo di sc-SAMMY-seq può rivoluzionare il campo del sequenziamento.
Tecnologia e nostra soluzione
Presentiamo un metodo basato su sequenziamento per mappare l'accessibilità di eucromatina ed eterocromatina (figura a seguire). Il metodo si basa sull'estrazione in sequenza di frazioni nucleari distinte contenenti: proteine solubili (frazione S1); il surnatante ottenuto dopo il trattamento con DNasi (frazione S2); cromatina DNasi-resistente estratta con un buffer ad alto contenuto di sale (frazione S3); e la porzione più condensata e insolubile di cromatina, estratta con urea che solubilizza le restanti proteine e membrane (frazione S4). Abbiamo ulteriormente adattato il metodo per eseguire il sequenziamento del DNA per la mappatura dell'intero genoma nelle frazioni distinte. Le frazioni insolubili sono riproducibilmente arricchite nelle regioni eterocromatiche associate alla lamina (LAD), mentre quella più solubile è correlata all'eucromatina (figura a seguire). Così con un protocollo unico siamo in grado di descrivere l'accessibilità di eucromatina ed eterocromatina.
Vantaggi
Il nostro protocollo risolve alcuni limiti sperimentali presenti in altri metodi per la mappatura delle regioni eterocromatiche. Innanzitutto, la procedura può essere applicata su cellule primarie, dal momento che non richiede l'espressione genica esogena come nella DamID-seq. Il SAMMY-seq non implica modifiche chimiche della cromatina, che potrebbero causare artefatti nel sequenziamento. Inoltre, non si basa su anticorpi per arricchire specifiche frazioni di cromatina, evitando così problemi legati alla specificità, alla produzione, alla variabilità dei lotti e alla reattività degli anticorpi. Questo è molto importante quando si studiano i cambiamenti epigenetici delle cellule in cui i livelli proteici dei fattori associati alla cromatina potrebbero essere alterati, consentendo così una maggiore flessibilità in termini di disegno sperimentale rispetto alle tecniche basate su anticorpi. Infine, SAMMY-seq è estremamente riproducibile anche a una profondità di sequenziamento inferiore o con un numero ridotto di cellule iniziali (10K). Il protocollo richiede circa 3 ore di lavoro al banco, escludendo l'estrazione del DNA e la preparazione della libreria.
Alcuni vantaggi della nostra tecnologia sono riassunti nella tabella sottostante.
Roadmap
Ipotetico prodotto industriale:
Kits per l'analisi dell'accessibilità genomica su un piccolo numero di cellule, che può essere utilizzato in campo biomedico es. per la diagnosi. Il kit conterrà: una soluzione ad alto contenuto di sale, reagenti per isolare materiale genetico dalle cellule, reagenti per purificare materiale genetico, uno o più enzimi di restrizione o una DNasi, reagenti per PCR che amplifica i loci bersaglio di interesse e reagenti per sequenziare i loci bersaglio amplificati di interesse utilizzando piattaforme di sequenziamento di DNA o RNA.
Kit per SAMMY-seq su singole cellule (sc-SAMMY-seq)
Fasi sperimentali:
Messa a punto di tamponi e reagenti per l'assemblaggio del kit.
Messa a punto della tecnologia sc-SAMMY-seq
Partner industriali:
Aziende coinvolte nel sequenziamento genomico. Aziende coinvolte nello strumento bioinformatico per l'analisi delle funzioni genomiche.
Aziende coinvolte nel sequenziamento genomico.
TRL
Il team
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